基因工程大纲

2007-12-28

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我也在找！！！！！

作者： 211.71.95.* 2006-3-9 22:38 　回复此发言

回复：基因工程

动物基因工程 (相关领域: 动物细胞工程)

1. 目的基因的分离和鉴定（限制性内切酶，基因文库）
2. 表达载体的构建（克隆载体，表达载体，
3. 目的基因的转化
4. 细胞的筛选及鉴定
5. 基因工程产业化的问题
1) 基因动物个体的应用（疾病模型、药物筛选、生物
反应器等）
2) 基因治疗与生物治疗
植物基因工程

1. 植物基因的分离和鉴定（限制性内切酶，基因文库）
2. 表达载体的构建（克隆载体，表达载体，
3. 植物的遗传转化
4. 转化细胞的筛选及转基因植物的鉴定
5. 基因工程与植物病虫害防御
6. 抗虫基因在农业上的应用
7. 基因工程与植物的雄性不育
8. 雄性不育的保持与恢复
9. 植物基因工程产业化的问题与绿色革命
10.转基因植物与医药开发
11. 植物品质与环境

作者：生物 2006-6-2 16:27 　回复此发言

回复：基因工程

为了研究特定的基因功能与其调控机制，有两种途径可供选择。
1. 从基因的终产物---蛋白质开始入手，然后到其编码基因。

分离蛋白质
测定其组成基本单位的氨基酸序列
人工合成为该氨基酸编码的可能的寡核苷酸序列
利用该寡核苷酸序列做为探针，到已建立的cDNA库或基因组文库中去“钓”出筛选目的基因（DNA）片断
利用DNA测序技术测定目的基因的核苷酸排列顺序
2. 从基因到蛋白质
分离基因组克隆（或突变体的DNA片断）
应用基因组DNA分离并得到cDNA
测定所得到的cDNA片断，并予测出组成蛋白质的氨基酸序列
利用功能己知的相关（高同源性）蛋白质的有关数据进行比较
研究，以予测目的基因之蛋白质的结构和生物活性
最后，应用基因表达载体将目的基因在体外、体内系统中进行
检测分析

作者：生物 2006-6-2 16:31 　回复此发言

回复：基因工程

(我的老师的讲义哦)
转基因技术的原理与用途?
包括: 1)基因过表达的动植物转基因技术以及
2)通过转基因（基因操作）技术将外源基因（或DNA片断）转入宿主（受体）细胞中并取代内源性功能基因的技术（如基因敲除术）。
研究基因的功能+基因表达调控的方法.
转基因动物:将目的基因通过实验导入的方法人工地导入某一动物的受精卵或胚胎干细胞中，并使其稳定地整合到宿主细胞染色体基因组上，使其在该动物的发育过程中表达外源基因并有蛋白质翻译产物。这些生物和基因遗传特性可以通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入外源目的基因的基因工程动物叫做转基因动物。

作者：生物 2006-6-2 16:35 　回复此发言

回复：基因工程

转基因工程动物的关键技术有以下5个方面
1.外源目的基因的制备。
2.有效地将外源目的基因导入动物的生殖细胞或胚胎干细胞中，并使其成功地整合入受体细胞的染色体基因组上。
3. 筛选获得携带有目的基因的转基因细胞，选择合适的体外培养系统和宿主（受体）动物。
4.转基因细胞胚胎发育及鉴定
5.筛选所得到的转基因动物品系
@_@转基因（动植物）技术的用途*_*
可培育出稳定高水平地表达外源目的基因的生物((((=====:
提供基础研究模型,进行目的基因\蛋白质的表达\调控等的研究,拟人疾病模型的开发应用,基因治疗,克隆技术的开发研究,生物反应器,农林鱼牧业
转基因动物是动物个体作为基因受体的基因表达载体(材料平台).目的基因导入动物体之后,其行为和表达调控与导入离体培养的动物细胞系有很大差别. 所以, 动物细胞系不能代替转基因动物

作者：生物 2006-6-2 16:47 　回复此发言

回复：基因工程

WHAT IS TRANSGENIC ANIMAL?
通过人工的方法(显微注射, 反转录病毒, 干细胞、精子转移) 将外源目的基因导入受体动物的受精卵或胚胎干细胞中.一条或两条受体动物的染色体上, 稳定地整合有外源目的DNA片断. 并在该动物的生长, 发育过程中表达目的基因.目的基因的生物和基因遗传特性可以通过生殖细胞传给后代.
转基因动物研究----是人为的,有选择的加速基因转移过程而已.
2.在有限的范围内,改造与改良某些生物的生物活性及其遗传特性,大量廉价生产人类所需的蛋白质产品.
MICRO-INJECTION显微注射:将外源目的基因DNA直接注射入单细胞胚胎的原核内, 而制备转基因动物.(操作技术难)@>------
显微注射#目的基因的构型, 末端结构, 长度与浓度, 克隆载体和溶解DNA的缓冲液等均对目的基因的转移, 整合以及表达有一定影响.

作者：生物 2006-6-2 16:57 　回复此发言

回复：基因工程

动物体细胞克隆生产转基因动物
1. 首先将目的基因转移到体外培养的动物体细胞中, 筛选出阳性转基因细胞并进行有限代数的繁殖, 制备出供移植的细胞核供体.
2. 制备成转基因细胞核供体后, 可以直接或经过冷冻保存后将它们移植到去核的卵母细胞中.
3. 重构胚胎经过激活和培养后, 移植到受体母畜的输卵管或子宫中.
4. 具体的移植部位视重构胚胎体外培养达到的阶段而定。
反转录病毒载体介导的基因转移
1. 为ＲＮＡ病毒, 感染细胞后其反转录成ＤＮＡ的遗传物质整合到宿主基因组中, 成为原病毒(1992, Goff).
2. 作为反转录病毒载体为有效的转基因法（人基因治疗）.
3. 但, 介导的基因转移生产出来的动物均为嵌合体.
4. 该载体的容量较小, 而限制其应用
多数反转录病毒只感染分裂中的细胞, 这是造成嵌合体的主要原因（Kulkosly, 1994). 而, 在卵母细胞阶段．将基因整合到染色体上, 受精之后发育成的胚胎就不会是嵌合体.
胚胎干细胞方法
1. 早于动物体细胞克隆法生产转基因动物.
2. 先用目的基因DNA转染胚胎干细胞---注入发育中的胚胎--移植到受体动物体中-----嵌合体---与野生型动物连续交配--转基因动物.％只有小鼠的干细胞可供商业使用. 需要中间的嵌合体阶段, 故较大型动物生殖周期长, 饲养费用高等, 限制广泛应用.
精子介导的基因转移
在一定条件下精子可以∶自发的结合DNA分子, 结合的部位在核后帽区域. 可能是该区存在一种带正电荷的膜蛋白(18-24kDa). 该蛋白质的抗体可使精子相互聚合, 并严重影响它的受精率.由于外源DNA相结合的是－种带阳电荷的膜蛋白, 任何带正电荷的分子都能封杀由于相互排斥而使精子保持独立运动的作用.

作者：生物 2006-6-2 17:04 　回复此发言

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转基因动物在生命科学研究中的应用
1. 研究基因的结构与功能
2. 研究基因的组织特异性表达
3. 研究发育相关基因的表达与调控
4. 用于克隆在发育中起重要作用的基因的研究
5. 基因多级调节系统的研究
6. 细胞功能的研究
转基因动物在医药研究领域中的应用
1. 研究病毒性疾病
2. 研究建立人类疾病的转基因动物模型
3. 转基因动物与基因治疗
4. 生产天然活性药物蛋白
5. 动植物物种的改良与保护
！目的基因的制备
I. 目的基因的来源
1. 采用限制性内切酶, 从基因细胞中获取目的基因.
2. 通过mRNA合成cDNA.
3. 人工体外合成DNA片段.
4. PCR扩增特定基因片段(对已有了解的基因).
II. 目的基因的克隆
1. 通过载体在适当的宿主中克隆（质粒, 噬菌体, 粘粒）.
2. 通过PCR反应克隆目的基因
嵌合体动物：由至少两种基因组结构不相同的细胞类型
构成的动物个体。它是由转基因和非转基因的两种细胞所组成的。
嵌合体是由于基因整合时染色体已复制，或者己整合的基因
从一个子染色体上丢失。
基因敲除：细胞在分裂、DNA复制合成的过程中，宿主细胞可将周围的核苷酸原料利用加工成自己遗传物质。这种宿主细胞在合成DNA时可特异性地与外源DNA的同源性DNA部分发生（交换）重组（同源重组）。利用这种性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因或研究某一功能基因的遗传生物特性
1. 目的基因序列的了解
2. 打靶载体的制备
3. 宿主细胞的制备（培养细胞、干细胞等）
4. 载体DNA的导入
5. 基因敲除后细胞的筛选（药物、PCR等）
6. 生殖细胞内的转入（显微操作）
7. 代理母亲体内移植
8. 子代的鉴定、种系培养
9. 纯合子个体的研究分析

作者：生物 2006-6-2 17:25 　回复此发言

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转基因动物：借助实验手段，将特定的目的基因从某一动物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在宿主动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。导入外源基因的动物称转基因动物。
一般情况下，限制酶能将外源DNA切割并降解掉，而细胞本身合成的DNA由于修饰酶的甲基化作用而避免了被限制酶降解从而保持遗传稳定性。但是，偶然也会发生外源DNA幸免降解的情况，使生物体产生小的变异。转基因技术就是利用生物这一特性，把外源基因注入细胞核而获得符合要求的转基因动物。
目的基因的制备（目的基因的来源；采用限制性内切酶，从基因细胞中获取目的基因。通过mRNA合成cDNA。人工体外合成DNA片段。PCR扩增特定基因片段＃目的基因的克隆；通过载体在适当的宿主中克隆。通过PCR反应克隆目的基因）
重组基因转入受精卵（显微注射法。反转录病毒感染法。胚胎干细胞法。精子载体法。脂质体法）
将转入了外源基因的受精卵植入同期发情的受体动物
检测、筛选
基因显微注射法; 卵供体母鼠：一般用4~6周鼠作为超排卵供体。正常公鼠：6~8周公鼠，与超排卵的母鼠交配。结扎公鼠：需8周以上，产生假孕母鼠。
超排卵与取卵
显微注射
卵的转移
转基因鼠的获得